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PM小鼠模型構(gòu)建
更新時間：2025-06-26
訪問量：22
廠商性質(zhì)：其他
一、PM小鼠模型構(gòu)建技術(shù)路線選擇
方法 | 周期 | 精度 | 適用場景 |
CRISPR-Base Editing | 2-3個月 | 單堿基 | C→T或A→G轉(zhuǎn)換（無需DSB） |
CRISPR-HDR | 3-5個月 | 任意突變 | 需設計ssODN供體 |
ES細胞同源重組 | 6-12個月 | 最高 | 復雜突變（如大片段替換+點突變） |
二、PM小鼠模型構(gòu)建CRISPR-HDR方案（當前常用）
1. 靶點設計與工具選擇
gRNA設計：
靶向突變位點附近（距離<10 bp），使用Benchling優(yōu)化特異性。
推薦工具：
單堿基編輯：ABE8e（A→G）或BE4max（C→T）編輯器。
HDR修復：高保真Cas9（如HiFi Cas9） + 化學修飾ssODN供體。
2. ssODN供體設計
5'同源臂 40-60nt
目標突變+沉默突變*
3'同源臂 40-60nt
沉默突變：在PAM序列或gRNA靶區(qū)引入1-2 bp沉默突變（防止供體重切）。
化學修飾：3'端硫代磷酸酯化（增強穩(wěn)定性，IDT可合成）。
3. 受精卵注射
注射混合物：
Cas9 mRNA (50 ng/μL) + gRNA (25 ng/μL) + ssODN (100 ng/μL)。
胚胎處理：
注射后培養(yǎng)至囊胚期，移植至假孕母鼠。
4. 基因型鑒定
初篩PCR：擴增含突變位點的片段（引物距突變位點>50 bp）。
深度測序：
使用ICE工具分析NGS數(shù)據(jù)，計算HDR效率。
敏感方法：ddPCR檢測低頻突變（<1%）。
5. 品系建立與驗證
傳代驗證：F0可能為嵌合體，需與野生型交配獲得穩(wěn)定遺傳。
功能驗證：
蛋白質(zhì)印跡（檢測突變蛋白表達）。
酶活檢測（如代謝酶突變需測活性）。
三、ES細胞打靶方案（超高精度）
1. 靶向載體構(gòu)建
同源臂設計：5'和3'臂各1.5-2 kb，中間含目標突變。
篩選標記：
正選擇：NeoR（后續(xù)可通過Flp刪除）。
負選擇：DTA（減少隨機整合）。
2. ES細胞篩選與驗證
陽性克隆鑒定：
長片段PCR（擴增整個重組區(qū)域）。
Sanger測序確認突變位點。
3. 小鼠制備
通過囊胚注射獲得嵌合體，與Flp deleter小鼠交配刪除NeoR。
四、Base Editing方案（無DSB風險）
1. 系統(tǒng)選擇
C→T突變：用BE4max + gRNA（靶向C在窗口4-8位）。
A→G突變：用ABE8e + gRNA（靶向A在窗口4-7位）。
2. 效率優(yōu)化
注射濃度：
BE4max mRNA (100 ng/μL) + gRNA (50 ng/μL)。
胚胎基因型：
需檢測旁系編輯（預測工具：BE-Hive)。
五、經(jīng)典案例解析
突變類型 | 疾病模型 | 構(gòu)建方法 |
BRAF V600E | 黑色素瘤 | CRISPR-HDR + ssODN |
TP53 R175H | Li-Fraumeni綜合征 | ES細胞同源重組 |
CFTR ΔF508 | 囊性纖維化 | Base Editing (C→T) |
六、常見問題與解決
問題 | 原因 | 解決方案 |
HDR效率低 | ssODN穩(wěn)定性不足 | 使用硫代磷酸酯修飾ssODN |
嵌合體突變丟失 | 生殖系未傳遞 | 增加F0交配數(shù)量，篩選生殖系傳遞后代 |
非預期旁系突變 | Base Editing脫靶 | 選擇高特異性gRNA，驗證全基因組脫靶 |
